Optisches Einfangen von U-Booten

Sep 14, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8615 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Während optische Pinzetten (OT) hauptsächlich zum Einschließen kleinerer Partikel verwendet werden, sind die gegenläufigen (CP) Doppelstrahlfallen eine vielseitige Methode zum Einschließen kleiner und größerer Partikel, einschließlich biologischer Proben. CP-Fallen sind jedoch komplexe empfindliche Systeme, die eine langwierige Ausrichtung erfordern, um eine perfekte Symmetrie mit im Vergleich zu OT relativ niedrigen Einfangsteifigkeitswerten zu erreichen. Darüber hinaus ist die Größe der Partikel, die CP-Fallen einschließen können, aufgrund ihrer relativ schwachen Kräfte auf etwa 100 μm begrenzt. In diesem Artikel wird eine neue Klasse gegenläufiger optischer Pinzetten mit gebrochener Symmetrie diskutiert und experimentell demonstriert, dass sie Partikel mit einer Größe von mehr als 100 μm in flüssigen Medien einfangen und manipulieren können. Unsere Technik nutzt einen einzelnen Gaußschen Strahl, der sich auf asymmetrische Weise in sich selbst zurückfaltet und eine CP-Falle bildet, die kleine und deutlich größere Partikel (bis zu 250 μm Durchmesser) allein auf der Grundlage optischer Kräfte einschließen kann. Ein solches optisches Einfangen großer Proben wurde unseres Wissens nach noch nie zuvor nachgewiesen. Die gebrochene Symmetrie der Falle in Kombination mit der Retroreflexion des Strahls hat nicht nur die Ausrichtung des Systems erheblich vereinfacht, sondern es auch robust gegenüber leichten Fehlausrichtungen gemacht und die Steifigkeit der Falle erhöht, wie später gezeigt wird. Darüber hinaus ist unsere vorgeschlagene Einfangmethode sehr vielseitig, da sie das Einfangen und Verschieben einer Vielzahl von Partikelgrößen und -formen im Bereich von einem Mikrometer bis zu einigen hundert Mikrometern, einschließlich Mikroorganismen, unter Verwendung sehr geringer Laserleistungen und numerischer Aperturoptiken ermöglicht. Dies wiederum ermöglicht die Integration einer breiten Palette von Spektroskopietechniken zur Abbildung und Untersuchung der optisch eingefangenen Probe. Als Beispiel werden wir zeigen, wie diese neuartige Technik das gleichzeitige 3D-Einfangen und Lichtblattmikroskopie von C. elegans-Würmern mit einer Länge von bis zu 450 µm ermöglicht.

Laser ermöglichen einzigartige Licht-Materie-Wechselwirkungen, die zu starken optischen Kräften, Partikelmanipulation und -einfang führen1,2,3,4,5,6,7,8. Das optische Einfangen ist ein vielseitiges Werkzeug mit vielen Anwendungsmöglichkeiten, das eine Fülle grundlegender Studien ermöglicht und seit seiner Entdeckung zahlreiche Bereiche der Wissenschaft und Technik revolutioniert hat9,10,11,12,13,14,15. Die einfachste und zugleich leistungsstärkste Implementierung optischer Fallen ist die Einstrahl-Gradienten-Kraftfalle, bekannt als optische Pinzette16,17,18. Bei dieser Methode entsteht die Falle, wenn ein Laserstrahl so stark fokussiert wird, dass auf das interessierende Teilchen ausgeübte optische Kräfte es einschließen. Diese Kräfte werden im Allgemeinen in zwei Hauptbeiträge eingeteilt. Eine davon sind die Gradientenkräfte, die Partikel mit höherem Brechungsindex im Verhältnis zum Hintergrundmedium in Bereiche mit größerer Laserintensität ziehen. Das zweite sind Streukräfte, die die Teilchen hauptsächlich entlang der Strahlausbreitungsrichtung schieben. Die letztgenannten Kräfte können dem Einfangen von Partikeln entgegenwirken und zu einer instabilen Falle führen, insbesondere bei größeren Partikeln (über 10 μm). Daher ist die Suche nach einem praktischen Ansatz zur Kompensation der nachteiligen Auswirkungen der Streukräfte ein entscheidender Schritt für ein stabiles optisches Einfangen. Eine gängige Lösung ist die Verwendung von Mikroskopobjektiven mit hoher NA (Numerical Aperture), um den Strahl eng zu fokussieren, sodass die Gradientenkräfte so weit ansteigen, dass sie die Streukräfte in axialer Richtung übertreffen. Eine solche Fokussierung erfordert typischerweise Mikroskopobjektive mit einer numerischen Apertur von mehr als eins (daher Immersionstyp). Dies führt zu einem kurzen Arbeitsabstand, einem engen Sichtfeld und extremen lokalen Intensitäten, die in der Regel im Widerspruch zu den Anforderungen praktischer Anwendungen, insbesondere in der Biologie, stehen. Ein weiterer Ansatz, der die oben genannten Nachteile vermeiden kann, ist die Verwendung zweier mäßig fokussierter, gegenläufiger (CP) identischer Strahlen19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30. Hier gleicht jeder Strahl die Vorwärtsstreukräfte des anderen aus und erzeugt so axiale Stabilität, um eine 3D-Falle zwischen den Brennpunkten der beiden Strahlen zu bilden. Ein solches optisches Einfangen innerhalb von Suspensionen wurde mithilfe von Objektiven mit hoher NA25,26, Objektiven mit niedriger NA19,31, zwei Fasern20,32,33,34, optischen Spiegelfallen35,36,37,38,39,40,41 und optischer Phase erreicht Konjugation42, holographische gegenläufige Fallen23,37,40 und stehende Wellen, die sich ideal zum Einfangen von Nanopartikeln eignen21,22,23,24,35,36,37,38,39. Da bei diesen CP-Einfangkonfigurationen das Einfangen zwischen den Brennpunkten erfolgt, die mehrere zehn Mikrometer voneinander entfernt sind, wird nicht nur die Lichtschädigung gemildert, sondern es ist auch der Einschluss größerer Partikel bis zu 100 μm (bekannt als Makrofallen) möglich36,37,41 .

Da die Falle jedoch zwischen den beiden Brennpunkten und leicht vom Strahlfokus entfernt gebildet wird (im Gegensatz zum OT), sind die Gradientenkräfte und damit die Steifigkeitswerte der meisten dieser CP-Strahlfangmethoden recht gering31,36,40. Dies könnte daher zu einer gewissen seitlichen Bewegung und langsamen Drehung des Objekts führen, insbesondere im Fall von Makrofallen41. Darüber hinaus ist ihre Einfangsteifigkeit sehr empfindlich gegenüber einer perfekten Ausrichtung, was auf die Symmetrieanforderungen der CP-Strahlfallen zurückzuführen ist. Infolgedessen könnte nicht nur die Ausrichtung der Dual-CP-Strahlmethoden eine Herausforderung darstellen, sondern auch die genaue Partikelpositionierung und Kraftmessungen sind auf die CP-Einfangkonfigurationen beschränkt. Dieses Problem verschärft sich, wenn der Brennpunktabstand vergrößert wird, um den Partikelmanipulationsbereich zu erweitern. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass bei CP-Fallen die optischen Kräfte und damit die Fallenstabilität stark von der Brennpunkttrennung abhängig sind31,36,43. Die Fragen, die sich hier stellen, sind die folgenden: Können wir die duale CP-Strahlkonfiguration ändern, um die Ausrichtungskomplexität zu vereinfachen und folglich die Einfangsteifigkeitsempfindlichkeit auf perfekte Symmetrie zu reduzieren? Und gibt es eine Möglichkeit, die Einfanggrößenbegrenzung zu erhöhen, um Partikel, die größer als 100 μm sind, stabil einzuschließen?

In einer früheren Studie haben wir die erste Frage beantwortet, indem wir duale asymmetrische gegenläufige Strahlen (ACP) zusammen mit der Verwendung von Komponenten mit geringer NA zur Bildung der optischen Falle verwendet haben44,45. Wir haben gezeigt, dass die im System mit zwei CP-Strahlen eingeführte Asymmetrie nicht nur die Einfangsteifigkeit erhöht (im Vergleich zu herkömmlichen CP-Strahlfallen), sondern auch den Ausgleich der axialen Streukräfte über eine große räumliche Länge ermöglicht. Dies wiederum ermöglichte ein stabiles Einfangen und Partikelmanipulation über einen Millimeterbereich, wobei die Einfangsteifigkeit nahezu unabhängig von der Fokustrennung blieb.

In diesem Artikel wollen wir uns mit der zweiten Frage bezüglich des Einfangens größerer Partikel befassen. Um dies zu tun, werden wir jedoch zunächst einen deutlich weniger komplexen Aufbau zur Erstellung von ACP-Fallen als zuvor diskutieren44. Wir werden zeigen, warum dieses System wesentlich einfacher auszurichten ist und deutlich weniger empfindlich auf Fehlausrichtungen reagiert. Als nächstes werden die Einfangeigenschaften des vorgeschlagenen Systems untersucht, was seine Fähigkeit zur einfachen Partikelmanipulation über große Entfernungen in flüssigen Medien zeigt. Unsere Ergebnisse deuten auf verbesserte Fallensteifigkeitswerte im Vergleich zu herkömmlichen symmetrischen Dual-CP-Fallen hin, wenn ähnliche experimentelle Bedingungen verwendet werden. Später beobachten wir die Anwendungen des vorgeschlagenen ACP-Strahlensystems beim Einfangen deutlich größerer Objekte, insbesondere länglicher biologischer Proben wie C. elegans-Würmer mit unterschiedlichen Längen (bis zu 450 µm), ausschließlich unter Verwendung optischer Kräfte. Abschließend zeigen wir, wie spektroskopische Bildgebungstechniken wie die Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie einfach in dieses stabile Einfangsystem integriert werden können, um detailliertere Bilder ohne Probenbewegung zu erzeugen.

Im ACP-Dual-Beam-Fallensystem44 verwenden wir im Gegensatz zum herkömmlichen symmetrischen CP-Beam-Aufbau zwei verschiedene Optiken mit sehr unterschiedlichen Brennweiten, um die Falle zu erzeugen. Dazu wird auf einer Seite der Probe eine Linse mit einer langen Brennweite von 15 cm (daher großer Rayleigh-Bereich) und auf der anderen Seite ein Low-NA-Objektiv (0,25 bis 0,4 je nach Partikelgröße) platziert . Während also eine Seite einen relativ engen Fokus erzeugt (OT-ähnlich), erzeugt die andere Seite einen nahezu kollimierten Strahl innerhalb der Probenkammer, der sich in die entgegengesetzte Richtung ausbreitet. Während in einem solchen System das Objektiv einen 2D-Einschluss (seitlich) ermöglicht, arbeiten die beiden ACP-Strahlen zusammen, um Streukräfte (axial) auszugleichen und so eine stabile 3D-Falle zu erzeugen. Da einer der beiden Strahlen innerhalb der Probe kollimiert wirkt und sich der engere Fokus seiner gegenläufigen Strahlen verschiebt, verschiebt sich die Falle ohne merkliche Stabilitätsänderung über Hunderte von Mikrometern, wie später gezeigt wird. Beachten Sie, dass aufgrund des verwendeten Low-NA-Objektivs thermische Effekte vermieden werden.

In dieser Arbeit verwenden wir zur Erzeugung der ACP-Falle ein im Vergleich zu unserer vorherigen Arbeit44 vereinfachtes System, das nur einen einfallenden Laserstrahl verwendet, wie in Abb. 1a zu sehen ist und im Folgenden beschrieben wird. Ein von links in das System eintretender Laserstrahl wird durch eine Linse (fl = 15 cm) fokussiert und bildet den ersten Fokus mit einer großen Rayleigh-Reichweite (zr ≈ 650 µm). Dieser Strahl wird dann von einem Mikroskopobjektiv mit niedriger NA gesammelt und auf den Endspiegel (M) gerichtet und in sich selbst zurückgefaltet, während er auf seinem Weg zweimal durch ein Filterrad mit variabler neutraler Dichte (VND) läuft, was Leistungsanpassungen ermöglicht. Der retroreflektierte Strahl gelangt direkt in die hintere Apertur desselben Mikroskopobjektivs und erreicht einen engeren Fokus (den zweiten Fokus) irgendwo innerhalb zr des ersten Fokus, während er sich in die entgegengesetzte Richtung ausbreitet und die ACP-Strahlfalle bildet. Jeder Strahl allein ist nicht in der Lage, ein Teilchen einzufangen, sondern stößt es vielmehr weg. Nur durch die Synergie der beiden Strahlen können wir eine dichte 3D-Falle erzeugen, die an jedem Punkt innerhalb und außerhalb von zr auftreten kann, gesteuert durch den Zielort. Abbildung 1b zeigt die potenzielle Landschaft, die durch die ACP-Strahlen erzeugt wird. Um Abb. 1b zu erhalten, haben wir den Strahlungsdruck aller einfallenden Strahlen als \({\mathrm{S}}_{\mathrm{z}}/\mathrm{c}\) berechnet, wobei \({\mathrm{S }}_{\mathrm{z}}\) ist der gesamte Poynting-Vektor in axialer Richtung und \(\mathrm{c}\) ist die Lichtgeschwindigkeit. Um die Potentiallandschaft von Abb. 1b zu erhalten, haben wir ein Pfadintegral des Strahlungsdrucks in der \(\mathrm{z}\)-Richtung von einem beliebigen Referenzpunkt zum interessierenden Ort durchgeführt. Das Ergebnis ist ein Potential, dessen Gradient den Strahlungsdruck an jedem Punkt der optischen Achse ergibt. Abbildung 1c zeigt den Aufbau, der in unserem Labor zur Erstellung der ACP-Falle verwendet wurde und sowohl Vorder- als auch Seitenansichtsaufnahmen umfasst. Um hier eine Frontansicht-Abbildung zu erhalten, ersetzen wir den Spiegel in Abb. 1a durch einen Kerbfilter (NF), der wie ein Spiegel für den Laserstrahl wirkt, der die Falle bildet, während er alle anderen Wellenlängen durchlässt. Das Objektiv (MO1) ist sowohl für die Vorderansichtsabbildung als auch für die Erzeugung des engeren Fokus für das optische Einfangen verantwortlich. Aus diesem Grund befindet es sich auf einer motorisierten Bühne, sodass die genaue Position seines Fokus in unserer Kontrolle liegt. Außerdem ist im System eine Viertelwellenplatte (\(\lambda /4\)) so platziert, dass sie die Polarisation des retroreflektierten Strahls ändert und so die Bildung stehender Wellen verhindert. Im Vergleich zu den herkömmlichen Dual-CP-Fallen ist unser Aufbau deutlich weniger komplex, einfacher auszurichten und robuster gegenüber leichten Fehlausrichtungen mit einer insgesamt größeren axialen Einfangsteifigkeit, wie später gezeigt wird. Diese sind hauptsächlich auf die Verwendung eines einzelnen retroreflektierten Strahls, eine Optik mit niedriger NA und die gebrochene Symmetrie der Strahlen zurückzuführen, die die Falle um ihre Mitte herum bilden.

Retroreflektierender ACP-Fallenaufbau mit einem einfallenden Strahl: (a) Die Grundidee der ACP-Fallenbildung: Der einzige von links in den Aufbau eintretende Strahl durchläuft die Linse und erzeugt einen losen Fokus mit einer großen Rayleigh-Reichweite, der kollimiert wird durch ein Low-NA-Mikroskopobjektiv und faltet sich durch den Endspiegel (M) in sich selbst zurück. VND ist ein Filterrad mit variabler Neutraldichte. (b) Ist eine Simulation des ACP-Systems, die die Bildung eines Potentialtopfs für die asymmetrische Falle demonstriert, wenn der Objektivfokus 500 µm vom Linsenfokus entfernt ist. (c) Der in unseren Experimenten verwendete retroreflektierende ACP-Aufbau: 830-nm-Laser (MSquared Equinox SolsTiS PI), L1 und L2: zwei Linsen mit f1,2 = 15 cm, L1 in Kombination mit MO1 (Olympus 20×/0,40 oder Olympus 10×/0,25 (abhängig von der Partikelgröße) erzeugt eine 3D-Falle basierend auf einem einzelnen retroreflektierenden ACP-Strahl. Bei Bedarf ermöglicht MO1 die Frontalansicht und -verfolgung, während L2 für die Frontalbildgebung verwendet wird. MO2: 4× (Olympus 4×/0,1) bis 20× (Olympus 20×/0,40) Objektiv für Seitenansicht. MO1 ist auf einem motorisierten Tisch (MS) montiert, der sich axial bewegt. BE-Strahlaufweiter, WL-Weißlicht, NF-830-nm-Notchfilter, der den 830-nm-Strahl reflektiert, DM-dichroitischer Spiegel, S: Probe und eine Viertelwellenplatte (\(\lambda/4\)), um die Strahlpolarisation danach um 90° zu ändern zweimal durchfahren. Bei den beiden Kameras handelt es sich um CMOS-Kameras.

Es gibt viele Studien, in denen ein retroreflektierter CP-Strahl zum Einfangen und Manipulieren von Nanopartikeln21,24,35,36,37,38,39 durch die Erzeugung stehender Wellen oder von Mikropartikeln36,40,41,43 zwischen zwei engen Brennpunkten von mehreren zehn Metern Höhe verwendet wird Mikrometer auseinander. Sie zeigen jedoch relativ niedrige Werte für die Fallensteifigkeit, die stark von der Brennpunkttrennung abhängt31,36,43. Dies wiederum begrenzt den Manipulationsbereich auf höchstens einige zehn Mikrometer und die niedrigen Steifigkeitswerte führen zu Partikelbewegungen und -rotationen, was bei bestimmten Mikroskopietechniken, die längere Scanzeiten erfordern, die Bildqualität verringern kann. Wie wir gleich sehen werden, erhöht das hier vorgeschlagene ACP-Einfangsystem nicht nur die Fallensteifigkeit, sondern behält auch ihren Wert nahezu unabhängig vom Brennpunktabstand bei, wodurch das Einfangen, die Abgabe oder die Abbildung größerer Partikel und Mikroorganismen ohne jegliche Bewegung ermöglicht wird.

Bei herkömmlichen CP-Einfangsystemen im Allgemeinen sind die Gradientenkräfte aufgrund der verwendeten Optik mit geringerer NA (in Bezug auf OT) geringer, insbesondere da die Falle aufgrund perfekter Symmetrie zwischen den Brennpunkten gebildet wird. Diese Kräfte sind noch schwächer, wenn der Brennpunktabstand auf mehrere zehn Mikrometer erhöht wird, um den Manipulationsbereich zu vergrößern31,36,43. In diesem Fall ist die axiale Einklemmung lediglich auf den Ausgleich der Streukräfte zurückzuführen. Bei ACP-Fallen können die Steifigkeitswerte jedoch aufgrund der gebrochenen Symmetrie der Balken erheblich verbessert werden, indem die Leistungsverhältnisse so angepasst werden, dass die Falle nicht irgendwo zwischen den Brennpunkten, sondern am Ort der entsteht engerer Fokus. Während in diesem Fall die axialen Streukräfte noch ausgeglichen sind, sind die vom Partikel wahrgenommenen seitlichen Gradientenkräfte aufgrund seiner Nähe zum engeren Fokus viel stärker. Dies liegt daran, dass ein Strahl fast kollimiert ist (über Hunderte von Mikrometern), während der andere viel enger fokussiert ist und schnell divergiert, wodurch sein Strahlungsdruck vom Fokus weg verringert wird. Folglich können wir durch Anpassen der Leistungsverhältnisse das axiale Gleichgewicht an der Stelle des engeren Fokus erzeugen, und wenn dieser Fokus verschoben wird (durch Bewegen des Objektivs), ändert sich auch die Position der Falle, wie in Abb. 2a schematisch dargestellt. Hier wird die axiale Position des durch den ACP-Strahl erzeugten Potentialtopfs (Fallenposition) vollständig von der Position des engeren Fokus dominiert, wie in Abb. 1b gezeigt. In dieser Abbildung befindet sich der Linsenfokus in der Position Null, während der Objektivfokus 500 µm entfernt ist, und wie im Diagramm dargestellt, stimmt die Position des erzeugten Potenzialtopfs mit dem Fokus des Objektivs überein.

Partikeltranslationsverhalten: (a) Eine schematische Demonstration der Fallenpositionstranslation durch Bewegen des Objektivs MO1. (b,c) Experimentelle Ergebnisse der Translation eines gefangenen 5-µm-Partikels (Polystyrolkügelchen) in Wasser entlang der ACP-Strahlen, während MO1 im freien Raum um 100/1,33-µm-Schritte verschoben wird (was sich auf 100 µm in Wasser bezieht). (b) Messungen der axialen und seitlichen Fallensteifigkeiten als Funktion der Fallenposition innerhalb der Suspension für das eingeschlossene 5-μm-Partikel. (c) Experimentelle Beziehung zwischen axialer Objektivverschiebung in Luft und axialer Partikelposition innerhalb der Suspension.

Unter Verwendung des in Abb. 1c gezeigten Aufbaus, bei dem L1 fl = 15 cm hat und MO1 ein 20-fach-Objektiv mit NA = 0,4 ist, haben wir die ACP-Falle generiert, um eine 5 µm große Polystyrolperle in einer 1 mm breiten, mit Wasser gefüllten Quarzküvette einzuschließen. Die verwendeten Laserleistungen betragen 50 mW bzw. 25 mW aus der Linse (L1) und dem Objektiv (MO1). Es können geringere Leistungen verwendet werden, dies verringert jedoch die Steifigkeit der Falle. Sobald ein Teilchen in die Falle fiel (was mit der Position des Fokus von MO1 zusammenfiel), konnte es durch Bewegen von MO1 entlang der ACP-Strahlen vorwärts und rückwärts bewegt werden. Experimentelle Messungen des Verschiebungsverhaltens eines gefangenen Partikels aufgrund der axialen Verschiebung des Objektivs und des Steifigkeitswerts der Falle an verschiedenen Stellen in einer Länge von 1 mm sind in Abb. 2b, c dargestellt. In Diagramm (b) wurde der Linsenfokus an der Stelle der linken Seitenwand der Küvette fixiert und das Objektiv wurde relativ zu dieser Wand in Schritten von 100 µm/nWasser außerhalb der Probenkammer und nach rechts bewegt, wo nWasser = 1,33. Der Inkrementwert entspricht einer 100 µm-Verschiebung des MO1-Fokus im Wasser. Wie in Abb. 2c gezeigt, folgt das eingefangene Partikel der Verschiebung von MO1 mit einem Verhältnis von nahezu eins zu eins bis zu einer Position von 500 µm innerhalb der Probe. Danach beginnt die Abweichung, das Teilchen verschiebt sich etwas weniger und die Linie beginnt sich zu krümmen. Diese Abweichung entsteht, weil die Streukräfte (axialer Strahlungsdruck), die durch den mäßig fokussierten Strahl (durch die Linse L1) auf das Teilchen ausgeübt werden, deutlicher abfallen, je weiter das Teilchen vom Fokus der Linse entfernt wird. Dies führt folglich dazu, dass sich die Falle etwas entfernt vom engeren Fokus bildet, wo sich die Axialkräfte ausgleichen.

Wir haben auch die Stabilität der ACP-Falle als Funktion der Partikelposition innerhalb der Probenkammer charakterisiert, indem wir die axialen und lateralen Steifigkeiten (κz, κx) gemessen haben. Abbildung 2b zeigt die Ergebnisse von Fallensteifigkeitsmessungen nach jeweils 100 µm axialer Partikelverschiebung innerhalb der Suspension für eine Länge von bis zu 1 mm. Bei diesen Messungen wurde die PSD-Methode (Power Spectrum Density) verwendet. An jedem Ort werden die Messungen zehnmal sowohl für die axiale als auch für die laterale Richtung wiederholt und gemittelt, um κz bzw. κx zu ermitteln. Die PSD wird ermittelt, indem das Partikel 10 s lang mit einer CMOS-Seitenkamera mit 1000 fps verfolgt wird. Der erste und letzte Datenpunkt werden 25 µm von der Wand entfernt gemessen, um Oberflächeneffekte zu vermeiden. Wie in Abb. 2b zu sehen ist, bleiben sowohl die axialen als auch die lateralen Steifigkeitswerte nahezu konstant, wenn wir die Fallenposition um bis zu ~ 500 µm verschieben. In diesem Bereich betragen die durchschnittlichen gemessenen Steifigkeitswerte κx = 7,7 pN/µm und κz = 3,8 pN/µm, was etwa eine Größenordnung größer ist als die konventionellen CP-Fallensteifigkeiten, über die zuvor berichtet wurde6,36,40,41 mit ähnlichen experimentellen Parametern gebraucht. Der Grund für diesen Anstieg der Steifigkeitswerte, den wir hier demonstrieren, liegt in der Asymmetrie unseres Systems, die dazu führt, dass sich die Falle sehr nahe am Fokus des Objektivs bildet, was zu erhöhten Gradientenkräften führt, die das Partikel spürt, unabhängig von der Brennpunktentfernung von bis zu ~ 500 µm. Bei den herkömmlichen CP-Fallen wird die Falle aufgrund der perfekten Symmetrie in der Mitte der Brennpunkte gebildet und abhängig von deren Abstand könnten die Gradientenkräfte auf das Partikel und folglich die Steifigkeitswerte deutlich kleiner sein. Als wir das Teilchen weiter aus dem Rayleigh-Bereich der Linse verschoben, blieb es eingeschlossen, aber die gemessenen Fallensteifigkeiten sanken. Dieses Ergebnis stimmt mit der in Diagramm 2c beobachteten Linienbiegung überein und ist darauf zurückzuführen, dass die Position der Falle vom Fokus des Objektivs abweicht, wenn das Partikel weiter vom Rayleigh-Bereich der Linse weg verschoben wird. Diese Abweichung verringert die vom Partikel empfundenen Gradienteneinfangkräfte, was zu einer Verringerung der Steifigkeitswerte führt.

Mit genau demselben Aufbau konnten wir Polystyrolpartikel mit Durchmessern zwischen 1 und 100 µm in einer wässrigen Suspension einfangen und verschieben. Diese Leistungsfähigkeit des Systems zeigt zusammen mit den in Abb. 2 dargestellten Ergebnissen die Flexibilität des ACP-Systems beim Einfangen und Manipulieren von Partikeln. Die Fähigkeit, die axiale Position der Falle mit Mikrometergenauigkeit über mehrere Hundert Mikrometer zu verschieben und zu steuern, ist ziemlich einzigartig. Diese Eigenschaften unterscheiden sich stark von den herkömmlichen CP-Fallen, bei denen ein gefangenes Partikel nur mehrere zehn Mikrometer bewegt werden kann, bevor es aus der Falle entweicht. Wenn sich bei symmetrischen CP-Fallen außerdem der Fokus eines Objektivs um die Distanz d innerhalb der Probe bewegt, bewegt sich das gefangene Teilchen um d/2. Alle diese Unterschiede ergeben sich aus der hier eingeführten Asymmetrie.

Um die Eigenschaften der retroreflektierten ACP-Fallen und deren Unterschiede zu den herkömmlichen CP-Fallen weiter zu untersuchen, haben wir die Axialkräfte beider Systeme theoretisch mit Parametern modelliert, die denen unserer Experimente ähneln. Die Ergebnisse dieser Studie werden hier kurz besprochen und sind in der ergänzenden Abbildung S1 ausführlicher zu finden. Unsere Berechnungen zeigen, dass bei der ACP-Falle das Partikel selbst bei großen Fokusabständen (von mehr als 500 µm) aufgrund der vorhandenen starken optischen Kräfte immer noch eingeschlossen werden kann. Dieses Ergebnis stimmt mit unseren in Abb. 2 dargestellten experimentellen Ergebnissen überein und erklärt, warum wir in der Lage sind, ein eingefangenes Teilchen problemlos um Hunderte von Mikrometern zu verschieben. Andererseits stehen unsere theoretischen Erkenntnisse für die symmetrische CP-Falle im Gegensatz zu denen der ACP-Falle (mit vergleichbaren lateralen Steifigkeitswerten). Wenn bei der symmetrischen CP-Falle der Fokusabstand größer als mehrere zehn Mikrometer wird, werden ihre Axialkräfte zu klein und eine stabile 3D-Falle wird unmöglich. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten über herkömmliche CP-Fallen überein, bei denen ihre Einfangsteifigkeit eine starke Funktion der Brennpunkttrennung ist36,43 und mit zunehmender Brennpunkttrennung schnell abnimmt. Dies wiederum begrenzt den Manipulationsbereich für CP-Fallen auf mehrere zehn Mikrometer. In einer weiteren theoretischen Studie untersuchten wir die Übersetzungsfähigkeit sowohl der ACP- als auch der CP-Falle, indem wir lediglich die Leistungsverhältnisse der beiden Seiten änderten. Unsere in der ergänzenden Abbildung S1a gezeigten Ergebnisse zeigen, dass eine Änderung der Leistungsverhältnisse in beiden Fällen die Position der Falle nur um einige zehn Mikrometer verschiebt. Insgesamt deuten unsere Erkenntnisse aus der Axialkraftstudie darauf hin, dass die beim herkömmlichen CP-Einfangsystem eingeführte Asymmetrie den optischen Kraftbereich erheblich erweitern und somit unsere Kontrolle über den genauen Einfangort innerhalb eines Millimeterpfads verbessern kann.

Bisher haben wir nur den Einschluss kleiner Partikel mithilfe der vorgeschlagenen retroreflektierten ACP-Falle demonstriert. Wie wir jedoch bald feststellen werden, eignet sich diese Technik sehr gut zum Einfangen deutlich größerer Partikel in Makrogröße, die kugelförmig oder nicht kugelförmig sein können. In diesem Abschnitt beginnen wir mit dem 3D-Einfangen großer Polystyrolkügelchen und demonstrieren dann den Einschluss lebender biologischer Proben. Mit dem Aufbau in Abb. 1c (wobei MO1,2 10-fache Objektive mit einer NA von 0,25 sind) konnten wir zunächst 150 µm große Polystyrolkügelchen in einer wässrigen Suspension einfangen, wie in Abb. 3a dargestellt. Das Video dieser Beschränkung finden Sie in der ergänzenden Visualisierung 1. Zu Vergleichszwecken haben wir der Suspension 10 µm große Polystyrolkügelchen hinzugefügt, wie in Abb. 3a dargestellt. Wir konnten das 150-µm-Partikel auch durch langsames Bewegen von MO1 verschieben. Eine Bildfolge, die die Translation dieser Perle zeigt, ist in der ergänzenden Visualisierung 2 dargestellt. Die zum Einfangen einer solchen großen Polymerperle verwendete Laserleistung betrug insgesamt 100 mW: 67 mW von der Strahlaustrittslinse L1 und 33 mW von dem austretenden retroreflektierten Strahl MO1 und Eingabe der Probe. Es ist wichtig anzumerken, dass in einer früheren Studie48 eine 100 µm große Polymerkugel zwischen zwei Fasern mit einer Einfangleistung von 800 mW von jedem Faserarm eingefangen wurde. Im Vergleich zu dieser Studie sind die in unserer Studie verwendeten Leistungsniveaus deutlich kleiner und die hier eingefangenen Partikel sind 1,5-mal größer. Die relativ geringe zum Einfangen erforderliche Leistung und die Fähigkeit, viel größere Objekte einzuschließen, weisen darauf hin, dass die ACP-Strahlfalle ein ideales Werkzeug zum Einfangen biologischer Proben ist.

Einfangen von viel größeren Objekten im Mikrometerbereich mit dem retroreflektierten ACP-Einfangsystem. Einschluss von: (a) 150 µm Polystyrolkügelchen, (b) 115 µm Volvox und (c) 250 µm Micrasterias Waris lebenden Mikroorganismen.

Als nächstes konnten wir mit dem gleichen Aufbau und den gleichen Parametern lebende Mikroorganismen von 115 µm Volvox (Abb. 3b) und 250 µm Micrasterias Waris (Abb. 3c) problemlos im Wasser einfangen. Das Video des gefangenen Micrasterias Waris ist in Supplementary Visualization 3 verfügbar.

Viele biologische Proben sind entweder länglich oder stäbchenförmig, wie zum Beispiel Chromosomen, intrazelluläre Organellen, eine Vielzahl von Bakterien und Parasiten, Membrantubuli, bestimmte Mikroalgen und Mikrowürmer. Das optische Einfangen solcher Proben erfordert in der Regel komplexe Systeme zur Strahlformung. Folglich kann das optische 3D-Einfangen stabförmiger Partikel in einer bestimmten Ausrichtung schwierig oder gar nicht möglich sein. Hier können wir durch die Integration eines zweiten Laserstrahls in das retroreflektierende ACP-Einfangsystem, wie in Abb. 4 gezeigt, problemlos längliche oder stabförmige Objekte einfangen, wie im Folgenden beschrieben. Der zweite Strahl, der bei einer etwas anderen Wellenlänge (λ = 785 nm mit ~ 30 mW) ausgewählt wurde, wird mit dem retroreflektierten 830-nm-Strahl unter Verwendung eines DM (dichroitischer Spiegel) kombiniert, wobei beide in MO1 eintreten und sich gleichzeitig ausbreiten. Die beiden Strahlen durchqueren die Probe (B2 und B3 in Abb. 4a) und fokussieren sich an zwei getrennten Orten, wo ihr Abstand einfach durch Bewegen der Linse L3 gesteuert werden kann (fl = 15 cm, was die Divergenz des 785-nm-Laserstrahls ändert). Die Kombination der drei Strahlen (B1, B2 und B3 mit jeweils ~ 80 mW, ~ 30 mW und ~ 30 mW) bildet eine 3D-Falle für längliche Objekte. Mit diesem System haben wir erfolgreich die Mikroorganismen Paramecium aurelia (Abb. 4c) und Caenorhabditis elegans (C. elegans) gefangen (Abb. 4d, e). Die eingeschlossenen C. elegans-Würmer befanden sich in unterschiedlichen Larvenstadien mit unterschiedlichen Größen zwischen 250 und 450 µm Länge. Die Medien einer Larve (Stadium L2), die in unserer dualen ACP-Falle eingesperrt ist, finden Sie in der ergänzenden Visualisierung 4.

(a) Das Schema der vorgeschlagenen Dual-Trap-ACP-Strahlen zur Eingrenzung länglicher Objekte mithilfe einer Kombination aus drei Strahlen. B1 ist der 830-nm-Strahl, der über L1 (fl = 15 cm) mit großer Rayleigh-Reichweite fokussiert wird, B2 ist der retroreflektierte Strahl, der über MO1 eng fokussiert wird (Olympus 10×/0,25). B3 ist ein 785-nm-Laserstrahl, der ebenfalls von MO1 etwas nach dem Fokus von B2 fokussiert wird. (b) Modifizierter faltbarer ACP-Strahlaufbau, um eine 3D-Eingrenzung für längliche Objekte zu erreichen. Hier ist MO1 10× mit NA 0,25, MO2 variiert zwischen 4×, 10× und 20× Objektiv je nach Objektgröße und Anwendung. (c–e) sind die Hellfeldbilder optisch gefangener Mikroorganismen: (c) 130 µm große Paramecium aurelia, (d) 260 µm große, (e) 385 µm große C. elegans-Larven.

Als nächstes fügten wir dem in Abb. 4b dargestellten ACP-Fangsystem Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie hinzu, um die gefangenen C. elegans-Larven gleichzeitig in 3D einzufangen und abzubilden. Für diese Mikroskopie wurden die Lipidtröpfchen in der Larve mit dem Fluoreszenzfarbstoff Nilrot (ein lipophiler Farbstoff, der in einer Lipidumgebung fluoresziert) angefärbt. Wie in Abb. 5a gezeigt, verwenden wir einen 532-nm-Laser, um den begrenzten gefärbten C. elegans-Wurm anzuregen. Der Strahl wird durch eine Zylinderlinse (CL mit fl = 7,5 cm) auf einen Lenkspiegel (SM) fokussiert und dann durch eine Relaislinsenkombination (zwei identische Linsen) zur hinteren Apertur des MO3-Objektivs (10× mit NA von 0,3) weitergeleitet L2 und L3 mit fl = 5 cm). Die Fluoreszenz wird senkrecht zur Beleuchtungsebene mit einem 20-fachen Wasserimmersionsmikroskopobjektiv (MO2) mit einer NA von 0,6 gesammelt und auf der CMOS-Kamera mit Draufsicht abgebildet. Das Hellfeldbild einer 450 µm großen, gefärbten C. elegans-Larve ist in Abb. 5b dargestellt. Ein Beispiel für ein Lichtschnittbild, das parallel zur Ebene, auf der die Larve liegt, aufgenommen wurde, ist in Abb. 5c dargestellt.

(a) Der vergrößerte optische Aufbau zeigt nur die Objektive und Linsen, die am optischen Einfangen (L1 und MO1) und der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (MO2, MO3 und L2 bis L4) beteiligt sind. Hier: CL-Zylinderlinse mit fl = 7,5 cm, MO3 ist ein 10-fach-Objektiv mit einer NA von 0,3 (Olympus UPlanFL N 10-fach/0,30), während MO2 ein 20-fach-Wasserimmersionsobjektiv mit einer NA von 0,6 ist (Thorlabs TL20X-MPL 20-fach/ 0,60 W/400–900 nm \(\infty\)/WD 5,5 mm). L2 und L3 sind Relaislinsensysteme, beide mit fl = 5 cm. Für die Bildgebung wird L4 mit fl = 10 cm verwendet. (b) Ist die Hellfeldmikroskopie einer 450 µm gefärbten C. elegans-Larve und (c) ist das Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopbild derselben Larve, die in (b) gezeigt wird.

Hierbei ist zu beachten, dass wir für kleinere eingefangene Objekte (≤ 100 µm) MO3 für die Lichtblattmikroskopie nicht hinzufügen mussten, da MO1 sowohl zum Einfangen als auch zur Lichtblattbildung verwendet werden konnte. Dies könnte leicht erreicht werden, indem ein dichroitischer Spiegel verwendet wird, um den Anregungslaser (hier 532 nm) mit dem retroreflektierten Strahl zu kombinieren, bevor er in MO1 eintritt. Hier haben wir nur eine mögliche Bildgebungstechnik (Lichtblattmikroskopie) demonstriert, die problemlos in unseren optischen Fallenaufbau integriert werden konnte. Da unser System jedoch im Gegensatz zu den meisten früheren Studien die Unterbringung von interessierenden Objekten in einer viel größeren Kammer und ohne enge physische Einschränkungen (z. B. Verwendung eines Deckglases oder Agarose) ermöglicht, ermöglicht es die Integration einer Vielzahl von Bildgebungstechniken ( mit großem Sichtfeld), um Bioproben und deren Entwicklung besser untersuchen zu können. Folglich verfügt unser System über das Potenzial für 4D-Bildgebung (3D-Bildgebung über die Zeit), um spezifische Dynamiken in Biomaterie zu untersuchen.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie das Brechen der Symmetrie des bekannten gegenläufigen optischen Einfangsystems die gesamten optischen Kräfte verändern kann, was zu einer erhöhten Einfangstabilität führt und das Einfangen und Manipulieren von Partikeln über große Entfernungen in flüssigen Medien ermöglicht. Zwar gibt es zahlreiche Berichte über die Partikelmanipulation über große Entfernungen mithilfe optischer Pinzetten, die meisten davon werden jedoch in Gas- oder Vakuummedien durchgeführt und basieren hauptsächlich auf thermophoretischen Kräften29,46,47. Hier fangen und manipulieren wir ein breites Spektrum an Partikeln unterschiedlicher Größe und Form, darunter auch Mikroorganismen, mithilfe von Strahlungsdruckkräften und ohne stehende Wellen22 oder thermische Effekte zu erzeugen. Aufgrund der durch die Linsen-Objektiv-Kombination erzeugten Asymmetrie um die Falle herum ist die Empfindlichkeit der Fallensteifigkeit bei der Fokustrennung extrem verringert, was wiederum das Einfangen bei erweiterter Fokustrennung ermöglicht, was mit herkömmlichen CP-Fallen nicht möglich ist. Darüber hinaus hat die gebrochene Symmetrie in Kombination mit der Retroreflexion des Strahls und der Verwendung nur eines Low-NA-Objektivs die Ausrichtung nicht nur erheblich vereinfacht, sondern sie auch sehr robust und kosteneffizient gemacht. Der vorgeschlagene ACP-Aufbau hat die axiale Einfangsteifigkeit im Vergleich zu den symmetrischen CP-Trägern mit ähnlichen experimentellen Parametern um mindestens eine Größenordnung erhöht. Während unser Aufbau die Einfachheit und Flexibilität einer optischen Einstrahlpinzette teilt, ermöglicht er die Verwendung von Objektiven mit sehr kleinen NAs zum Einfangen von Partikeln. Dies führt zu einem größeren Arbeitsabstand und Sichtfeld und vermeidet gleichzeitig unerwünschte thermische Effekte. Dies ist von besonderem Interesse, wenn ein nicht-invasives Einfangen und Manipulieren im Fernfeld in flüssigen Medien erwünscht ist. All diese Vorteile machen dieses System sehr praktisch für das optische Einfangen über große Entfernungen für eine Vielzahl von Proben und ermöglichen die Möglichkeit der Integration spektroskopischer Mikroskopietechniken, wie hier gezeigt. Es ist erwähnenswert, dass in den letzten Jahren Techniken wie optische Spiegelfallen36,37 (oder optische Makropinzetten41) alle einen Spiegel hinter der Probe verwenden, um sich gegenläufig ausbreitende Einfangstrahlen zu erzeugen, es gibt jedoch große Unterschiede. Während die meisten dieser Studien einen räumlichen Lichtmodulator (SLM) verwenden, was ihren Aufbau recht komplex und teuer macht, wird der verwendete retroreflektierende Spiegel in der Probenkammer platziert, was sowohl die Probenvorbereitung als auch die Seitenansichtsbildgebung zu einer großen Herausforderung macht. Bei unserer vorgeschlagenen Methode wird der Spiegel (bei dem es sich um einen NF handelt) weit von der Probe entfernt platziert, sodass ein seitlicher Sichtzugang möglich ist, ohne dass eine spezielle Probenvorbereitung oder komplizierte Bildgebungstechniken erforderlich sind. Darüber hinaus schafft die einzigartige Asymmetrie unserer Einfangbalken stabile 3D-Einfang- und Manipulationsmöglichkeiten im Millimeterbereich mit verbesserten Steifigkeitswerten, die in den oben genannten Studien aufgrund ihrer Balkensymmetrie nicht vorhanden waren.

Die Daten sind nicht öffentlich verfügbar, können aber auf begründete Anfrage von Shima Fardad bezogen werden.

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Fakultät für Elektrotechnik und Informatik, University of Kansas, Lawrence, 66045, USA

Laurynas Lialys, Justinas Lialys, Alessandro Salandrino und Shima Fardad

I2S, Institut für Informationswissenschaften, University of Kansas, Lawrence, 66045, USA

Alessandro Salandrino & Shima Fardad

Abteilung für Molekulare Biowissenschaften, University of Kansas, Lawrence, 66045, USA

Brian D. Ackley

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LL und JL haben das System entworfen und eingerichtet, die Experimente durchgeführt und die Daten gesammelt. SF, AS und BA haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Shima Fardad.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Ergänzende Informationen 2.

Ergänzende Informationen 4.

Ergänzende Informationen 5.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lialys, L., Lialys, J., Salandrino, A. et al. Optisches Einfangen von Partikeln und Mikroorganismen im Submillimeterbereich. Sci Rep 13, 8615 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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Eingegangen: 02. März 2023

Angenommen: 24. Mai 2023

Veröffentlicht: 27. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35829-7

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